[내과] 줄기세포를 이용한 혈관신생 요법

김 효 수 서울의대 서울대병원 내과 Hyo-Soo Kim, MD. & Ph.D. Dept. of Internal Medicine, Seoul National University Hospital, Seoul National University College of Medicine.

줄기세포란 무엇인가?   줄기세포란 스스로 증식하며 여러 가지 방향으로 분화할 수 있는 능력을 가진 세포를 말한다. 태아기에는 모든 수준의 줄기세포가 존재하는데, 모든 형태의 세포로 분화가 가능한 totipotent stem cell(ES cell)로부터 - pluripotent stem cell - determined stem cell - committed progenitor cell - precursor cell 등이 있고 이 순서대로 분화하면서 최종적으로 differentiated cell로 된다. [Alison et al., 2002] 한편 성인의 몸은 대부분 분화된 세포로 구성되어 있다고 생각하겠지만, 어느 정도 수준의 줄기세포가 소수 존재하고 있다. 가장 상위에 있다고 생각되는 것이 determined stem cell로서, 분화할 수 있는 세포의 형태가 어느 정도 한정된 줄기세포인 인 것이다. 즉, ⑴ neural stem cell, ⑵ hematopoietic stem cell, ⑶ mesenchymal stem cell 등이 대표적인 것이다. 따라서 성인의 몸에서도 각 장기별로 줄기세포가 존재하면서, 생리적 혹은 병적인 자극에 의해서 증식-분화하여 세포의 소실을 보충하는 역할을 수행하고 있다.     <Table 1>을 보면, 왼쪽 칸에는 태아기 때에 관찰되는 다양한 등급의 줄기세포를 예시해두었다. 이에 상응하는 성체 줄기세포가 오른쪽에 표시되어 있다. 혈관신생 목적으로 사용하는 endothelial progenitor cell (EPC)은 committed progenitor cell 등급에 해당하며, 심근재생목적으로 사용하는 mesenchymal stem cell은 한 단계 위인 determined stem cell 등급이라고 추정된다. 한편 skeletal myoblast는 EPC와 비슷한 등급으로 추정된다.     왜 줄기세포를 이용하는가?   허혈성 심혈관 질환은 21세기에 들어서 사회경제적인 부담이 가장 심각할 질환임에 틀림없다. 이에 대한 치료법으로서 현재 약물요법, 수술요법이 확립되어 있으나, 이러한 전통 요법으로도 만족스럽게 치료가 되지 않는 환자들이 엄연히 존재하고 있다. 이들을 위해서 혈관신생과 심근재생을 위한 유전자요법이 도입되어 미국을 중심으로 임상시험이 진행되고 있으나, 적용을 할 만한 대상환자의 수가 적고 유전자요법의 효과가 획기적인 수준까지는 미치지 않아서 본격적으로 도입이 되기에는 몇몇 관문을 넘어야 할 상태이다.  이러한 정체를 돌파하기 위한 대안으로서 줄기세포를 이용한 혈관신생과 심근재생요법이 제안되고 있다. 환자 자신의 세포를 혈액이나 골수에서 채취하여 허혈 부위나 경색 심근 주위에 다시 주입하면 된다는 편의성과, 줄기세포에 치료유전자를 실어 넣으면 유전자요법의 효과까지도 볼 수 있다는 장점 때문에 현재 전세계적으로 수많은 연구실에서 경쟁적으로 이 분야의 연구에 뛰어 들고 있는 형국이다.     성체줄기세포와 배아줄기세포 중 어느 쪽을 선택할 것인가?   줄기세포를 이용한 혈관신생, 심근재생 요법 개발 분야에서는 현재 성체줄기세포를 이용하고 있다. 성체줄기세포는 ⑴ 윤리적 시비 거리가 없으며, ⑵ 환자의 몸에서 추출하여 다시 주입하는 자가이식이 가능하다는 점, ⑶ 어느 정도 특정 세포형으로 분화가 약속된 상태이므로, 특정 장기를 재생시키는 목적으로 사용하기에 유리하다는 점과 따라서 ⑷ 특정한 방향으로 분화를 유도하는 법을 찾아야 하는 전제조건이 필요 없다는 등의 장점이 있으므로, 배아줄기세포 대신 이 분야에서는 성체줄기세포를 이용하고 있다.     성체 줄기 세포의 족보는?   출생 후의 성체 내에서도 줄기세포를 발견할 수 있다. 대부분은 골수에 존재하지만, 말초 장기에서도 발견된다. 즉, 말초혈액, 뇌, 간, 췌장, 피하조직, 골격근, 심근 등에서도 극소량 존재하면서, 각 장기의 손상에 대해서 재생을 담당하고 있다고 생각된다. <Fig. 1>은 이들 다양한 줄기세포의 족보와 각 줄기세포들이 3가지 배엽중 어디에 해당하는지를 표시한 것이다.       줄기세포를 이용한 혈관 신생 요법   1. 혈관내피-전구세포(endothelial progenitor cell : EPC) 란 ? 1997년 Tufts 대학의 St. Elizabeth Medical Center의 아사하라 등이 말초혈액내에서 CD34 양성인 세포를 분리하여 배양한 결과 이들이 혈관내피세포로 분화하며 생체 내에서 신생혈관 형성에 참여한다는 사실을 발표하면서 혈관내피-전구세포(EPC)가 처음으로 알려지게 되었다. 발생,분화 측면에서Hematopoietic stem cell(HSC)과 가까우며, Flk-1(KDR), tie-2,CD34, Sca1,c-kit 등의 마커는 EPC와 HSC에서 공통적으로 발현되었다. 단 양 세포도 서로 각자의 방향으로 분화하면서 차이가 나게 되는데, 내피세포로 가면 VeCadherin이 양성으로 되지만, 혈액세포로 가면 VeCadherin이 양성으로 되지 않는다. HSC가 혈액세포로 분화하게 되면 CD34, Flk-1도 없어지게 된다.   혈관내피-전구세포를 확인하는 방법은 위에서 언급한 마커들이 양성이면서, 내피세포 고유의 기능이나 표면 항원을 가지고 있는지 확인하는 것이다. 즉, ⑴ DiI-acetyl LDL을 섭취하는 것, ⑵ VEGF 자극에 의한 nitric oxide 생산을 DAF-2DA 형괄물질로 확인하는 것, ⑶ PECAM-1(CD31) 양성, ⑷ vWF 양성, ⑸ vascular endothelial cadherin양성, ⑹ KDR 양성 등을 확인하면 됨.        2. 혈관내피-전구세포의 세 가지 근원 ; 말초혈액, 골수, 제대혈 혈관내피-전구세포는 다음의 세 가지 혈액에서 채취할 수 있다. ⑴ 말초혈액 간편하게 채취할 수 있다는 장점이 있지만, 단핵구 중에서 혈관내피-전구세포의 비율이 0.2%에 불과하기 때문에 충분한 수의 세포를 확보하기가 어렵다는 단점이 있다. 이 한계점 때문에 혈관내피-전구세포의 동원(mobilization)이 중요한 변수로 부각되고 있다. ⑵ 골수  채취하는데 환자에게 고통을 주기 때문에 어려운 점이 있으나, 단핵구 중에서 혈관내피-전구세포의 비율이 3%에 달하기 때문에 효율이 좋은 장점이 있다. ⑶ 제대혈 (umbilical cord blood) 상기 두 가지 채취원과는 달리 자가 이식이 불가능하기 때문에 당장 임상적으로 적용하기는 어렵지만, 출생 시에 제대혈을 냉동 보관하는 경향이 최근에 일어나고 있기 때문에 장차 적용 가능성이 없지는 않다. 장점으로서는 성인의 골수 세포보다 자가분열 능력이 뛰어나고, 세포분열이 빠르며 telomere가 상대적으로 길어서 여러 가지 면에서 우수한 줄기세포를 제공하는 근원이 된다. 혈관내피-전구세포의 비율도 단핵구중의 2%를 차지할 정도로 풍부하다.        3. 실험 동물에서 혈관내피-전구세포를 이용한 혈관신생요법의 가능성이 확인되고 있다. 현재까지 말초혈액, 골수, 제대혈에서 추출한 혈관내피-전구세포를 이용하여 실험동물에서 허혈하지 혹은 허혈심근에 혈관신생을 도모한 연구들이 소수 발표된 바 있다.   ⑴ 말초혈액에서 채취한 혈관내피-전구세포를 이용한 연구들 : 아사하라 그룹은 인간의 말초혈액에서 채취한 단핵구를 체외에서 증폭한 후 이를 누드마우스의 심장내강에 주사하여 허혈하지의 혈관신생을 도모하고 허혈하지의 생존을 증가시킴을 보고하였다. 이 연구자들은 나아가서 누드래트의 심근경색모델에서 인간 말초혈액에서 채취한 혈관내피-전구세포를 체외에서 증폭한 후 쥐에게 정맥 주사하여 심근경색증을 줄이고 심근의 기능을 향상시키는 긍정적인 효과도 보고하였다.   ⑵ 골수에서 채취한 혈관내피-전구세포를 이용한 연구들 : 역시 아사하라 그룹에서, Flk-1/LacZ 혹은 Tie2/LacZ 쥐의 골수를 방사선조사를 당한 다른 쥐에게 이식시킨 후, 혈관신생을 일으키는 각종 상황을 연출하고 골수 유래의 세포가 어느 정도 혈관신생에 참여하는 지를 분석하였다. 즉 난소에 호르몬으로 배란을 유도하거나, 상처 후 치유과정을 관찰하거나, 허혈하지, 허혈심근을 만들거나, 종양세포를 이식하여 암을 유도하는 등의, 혈관이 새로 생기는 상황에서 골수로부터 유래한 X-gal 양성인 세포가 신생혈관 형성에 참여하는 것을 증명하였다. 한편 일본의 또 다른 선도연구자인 무로하라 그룹에서는 토끼의 골수에서 채취한 단핵구를 체외에서 증폭하고 혈관내피-전구세포로 분화시킨 후, 이를 허혈 하지에 근육 주사하여 허혈이 개선됨을 증명하였다. 나아가서 돼지의 골수에서 단핵구를 채취하고 이를 바로 허혈심근에 근육 주사하여 심근허혈을 줄이고 심장기능을 개선시킴도 증명하였다.   ⑶ 제대혈에서 채취한 혈관내피-전구세포를 이용한 연구 : 일본 구루메대학의 무로하라 그룹은 인간의 제대혈에서 CD34 양성 세포를 분리하고 체외 증폭한 후 이것이 혈관내피-전구세포라는 것을 확인한 후, 이를 누드래트의 허혈하지에 근육 주사하여 혈관신생을 유도하고 하지의 허혈을 감소시킴을 증명하였다. 위에서 서술한, 실험동물에서 혈관내피-전구세포를 이용한 혈관신생요법의 국외 개발 현황을 요약하면;   첫째, 줄기세포의 채취원 문제 : 말초혈액, 골수, 제대혈이 모두 검증되었고, 둘째, 줄기세포의 체외 증폭 문제 : 체외 증폭하거나 혹은 체외증폭 없이 골수에서 채취한 단핵구를 직접 이식하는 것도 검증되었으며, 셋째, 줄기세포 주입방법 문제 : 정맥주사, 심강 내 주사, 그리고 하지 혹은 심근에 직접 근육주사법이 모두 이용되었고, 넷째, 허혈 부위 문제 : 정상적 생리적인 혈관신생뿐만 아니라, 허혈하지와 허혈심근의 치료에 효과가 있음을 증명하였고, 다섯째, 실험동물 문제 : 마우스, 래트, 토끼, 돼지에 이르기까지 모든 실험동물에서 검증되었다.     줄기세포를 이용한 심혈관 환자 치료 현황   1. 줄기세포를 이용한 혈관신생요법과 심근재생요법의 임상적 적용이 국외에서 시작되었다. 줄기세포를 이용한 혈관신생요법 개발 분야의 임상적 적용 현황을 살펴 보면, 단계적이고도 완벽한 전임상실험(preclinical study)의 결과를 토대로, 무로하라가 참여한 일본의 여러 대학을 망라한 연구 그룹은 허혈성 하지 질환을 앓고 있는 환자들을 대상으로, 세계 최초의 줄기세포를 이용한 혈관신생요법을 수행하여 긍정적인 결과를 보고하였다.   한편, 허혈성심질환자에서 줄기세포를 이용한 심근재생요법의 임상적 적용 현황을 살펴보면, 우선 프랑스에서 수술적으로 환자의 경색 심근 부위에 환자 자신의 골격근 유래의 근육모세포를 주입한 후, 5개월 후에 평가한 결과, 이식된 세포가 주입된 경색 심근 부위에 살아있으며, 심근 수축기능을 향상시키는데 이바지 함을 증명하였다. 현재 골격근 근육모세포를 사용하여 9명의 환자를 대상으로 하는 제1상 임상시험이 진행 중임. 일본에서는 관동맥우회로 수술을 받는 5명의 환자를 대상으로 우회로를 만들 수 없는 부위에 환자 자신의 골수로부터 채취한 단핵구를 주입한 결과, 치명적 부작용은 없었음을 보고하였음. 독일에서도 심근경색증후 환자자신의 골수단핵세포를 분리하여 관동맥에 주입해 줌으로써 심기능의 호전을 보였다는 보고가 있다.         2. 줄기세포를 이용한 혈관신생요법과 심근재생요법의 임상적 적용; 서울대학교병원의 경험 서울대학교병원 심혈관센터에서도 2002년 12월부터 심근경색증 환자의 경색 심근을 재생시킬 목적으로 줄기세포 요법을 시행하고 있다. 기존의 국외연구와는 달리 두가지 측면에서 진일보한 방법을 사용하고 있다. 첫째는 골수채취를 하지 않고 줄기세포를 취득하는 간편한 방법인, 줄기세포 동원요법을 시행하고 있는 것이다. 즉 G-CSF라는 약을 3일간 피하주사를 하여 골수의 줄기세포를 유인하여 말초혈액으로 불러내어 말초혈액을 채취함으로써 줄기세포를 획득한다는 전략이다. 둘째는 수술적으로 줄기세포를 심근에 주입하는 것이 아니고, 관동맥 조영술을 하듯이 도관을 통하여 내과적으로 경색심근에 관동맥을 경유하여 줄기세포를 주입한다는 것이다(Fig.2).     그 동안 50여명을 치료해 왔는데, 중간 결과를 점검해본 결과, 경색심근이 재생되어 심기능이 호전함을 확인하고, 2004년 3월 6일자 Lancet 지에 논문을 게재함으로써  세계학계에 보고를 한 바 있다. 이러한 세포치료법은 향후 심근경색증 환자의 예후를 향상시키는 매우 유용한 치료법으로 자리를 잡을 것으로 예상한다.     앞으로의 숙제는 무엇인가?   전술한 동물실험들의 긍정적인 결과에도 불구하고, 그 이면에는 몇 가지 한계점들이 잠재하고 있다. 첫째, 혈관내피-전구세포나 간엽세포/근육모세포 등을  충분히 확보하는데 항상 어려움이 있다는 것과, 둘째, 실제로 허혈부위의 신생혈관에 참여하는 줄기세포의 비율이나 주입된 심근 내에서 심근 세포로 분화하는 줄기세포의 비율이 저조하다는 것이다. 즉 보다 많은 양의 줄기세포를 확보하고 이를 되도록 많이 허혈 부위 혹은 경색 심근 부위에 투입되도록 하는 전략이 필요하다.  ⑴ 줄기세포 능력 측면의 개선 ⑵ 줄기세포 동원(mobilization) 측면의 개선  ⑶ 줄기세포 귀환(homing) 측면의 개선 즉, 많은 줄기세포를 골수로부터 동원시켜, 이를 유전적 변형을 통해서 세포분열과 혈관신생/심근재생 기능을 증강시킨 후, 표적 부위에 집중적으로 귀환시키는 방법을 개발해야 한다는 것이다.     결 론   궁극적으로 성체 줄기세포를 이용한 혈관신생, 심근재생 요법을 확립할 수 있는가 ? 이미 일본과 유럽에서 환자에 적용하여 큰 부작용은 없는 것으로 드러나고 있으나, 아직 초보단계에 불과하다. 앞으로 더 많은 환자를 대상으로 그 안전성과 경제성, 그리고 현실적 적용 가능성 등이 타진될 것으로 예상된다. 이러한 1단계 임상시험이 성공한다면, 좀 더 세련된 전략이 적용되리라고 판단된다. 즉 ⑴ 골수로부터 말초혈액으로 줄기세포의 동원을 극대화하고, ⑵ 동원된 줄기세포를 유전자 변형을 통해서 분열능, 분화능, 생존능을 강화시킨 후, ⑶ 병행 국소 유전자 요법을 통해서 표적장기로의 귀환을 향상시키는 2단계 임상시험이 성공한다면, 강력한 세포이식 치료법이 확립되어, 전통적 요법으로는 미흡한 많은 심혈관질환 환자들에게 큰 도움이 되리라고 예상된다.   [출처 : DiaTreat Vol4. No2.]